Sono giunti i primi risultati in merito al progetto di ricerca sulla “leucemia mieloide acuta”, sostenuto dalla nostra Associazione con un premio ad un tecnico di laboratorio, per ricordare Alfredo Tamburello, figlio di Carlo e Paola, nostri cari amici, vittima di questa malattia. Alfredo aveva 24 anni, oltre ad essere studente faceva l’arbitro di calcio ed era molto promettente. Ha combattuto con la forza dei giovani fino all’ultimo momento, ma non ce l’ha fatta.
***

PROGETTO

Colture a lungo termine di blasti leucemici su supporto di cellule staminali mesenchimali eterologhe estratte da cordoni ombelicali alla nascita.

La leucemia mieloide acuta (LMA) rappresenta il tumore più studiato nell’ambito della ricerca onco-ematologica e la possibilità di potere mantenere in coltura le cellule leucemiche (blasti) offre il prezioso vantaggio di sperimentare l’efficacia citostatica di alcuni farmaci in provetta per poi traslare i risultati positivi sul paziente. Lo sviluppo di questo protocollo anche su blasti congelati consene di eseguire importantissimi studi retrospettivi di efficacia di nuovi farmaci.
Questo progetto si propone di mantenere in coltura i blasti leucemici di pazienti all’esordio della malattia e di sfruttare cellule staminali mesenchimali (MSC) estratte dalla matrice gelatinosa di cordoni ombelicali alla nascita (gelatina di Wharton (WJ-MSC), per fornire il supporto necessario al loro mantenimento.

Isolamento delle MSCs da gelatina di Wharton (WJ-MSC) di cordoni ombelicali ed espansione.

Sono state isolate le cellule mesenchimali da 3 cordoni ombelicali alla nascita, previo consenso informato della madre donatrice. I cordoni, svuotati del sangue cordonale, sono stati tagliati in pezzi di circa 1,5 cm e aperti per fare aderire la parte interna (la gelatina della parete) alla plastica e lasciati ad incubare in presenza di CO2 al 5% in terreno di coltura (DMEM). Dopo 15 giorni, i pezzi di cordone venivano rimossi e le cellule adese alla piastra venivano staccate con tripsina ed espanse in diverse piastre. Il passaggio delle cellule è stato eseguito per 3 volte, ogni volta che le cellule reggiungevano la confluenza. Al terzo passaggio le cellule venivano caratterizzate al citofluorimetro per la presenza di molecole della membrana cellulare tipiche delle cellule mesenchimali : CD71, CD105, CD90 e per l’assenza delle molecole CD34 e CD45. Inoltre, dopo espansione un’aliquota di cellule è stata caratterizzata per verificare la capacità di differenziare nei 3 tipi cellulari canonici. Le cellule rimanenti sono state congelate per il successivo uso.
Le cellule leucemiche provenienti da un paziente con diagnosi di LMA all’esordio della malattia sono state isolate e caratterizzate mediante citofluorimetria. Le cellule risultavano per la quasi totalità positive per la molecola di membrana CD34 (97.4%) che è una delle molecole caratteristiche dei blasti.

Studio di mantenimento in coltura dei blasti leucemici

Per stabilire le condizioni ottimali di coltura per mantenere le cellule leucemiche, i blasti isolati sono stati messi in coltura in presenza o in assenza dello strato di cellule mesenchimali espanse (WJ-MSC), ed inoltre in presenza o assenza di fattori di crescita (FC). Gli stessi blasti sono stati coltivati in presenza di WJ-MSC ma non a diretto contatto, per stabilire l’effetto delle sostanze rilasciate dalle WJ-MSC a confronto con il contatto diretto tra i due tipi cellulari.

I risultati ottenuti in questo primo esperimento:

– Le cellule leucemiche mostrano un declino numerico di circa il 50% dopo 7 giorni di coltura a contatto con le cellule mesenchimali (WJ-MSC) ed in assenza di fattori di crescita (linea verde). Il declino è più accentuato in tutte le altre condizioni, compresa quella a contatto con le cellule mesenchimali e con l’addizione di fattori di crescita (linea viola).
– Dopo 21 giorni, il numero dei blasti nella prima condizione si mantiene pressochè invariato mentre nelle altre condizioni continua a diminuire.

IN CONCLUSIONE

Il contatto con le cellule WJ-MSC è in grado di fornire ai blasti le sostanze e gli stimoli necessari al loro mantenimento in provetta. La condizione in cui i blasti sono messi in crescita in presenza delle cellule WJ-MSC ma sono separati da una membrana, dimostra che il contatto tra i due tipi cellulari è essenziale.
I successivi esperimenti saranno condotti al fine di:
– Confermare questi risultati con campioni di altri pazienti;
– Settare ulteriormente le condizioni ottimali di mantenimento, modificando per esempio la densità cellulare, per evitare o diminuire la mortalità dei blasti che si è osservata nei primi 7 giorni;
– Caratterizzare i blasti a diversi giorni di coltura per verificare la fedeltà delle cellule durante il tempo di mantenimento.
– Infine sarà importante ripetere lo stesso esperimento con i blasti dopo un ciclo di congelamento e verificare se è fattibile usare questo sistema per studi retrospettivi.